CP-1細胞(bāo)凍存液(臨床級(jí)凍存液)
・獲得日本(běn)再(zài)生醫學等產品(pǐn)材料(liào)的資格(gé)認(rèn)證
1.產品(pǐn)從1992年開始(shǐ)推廣(guǎng)應用
2.在(zài)日(rì)本國內的GMP設備中(zhōng)生產(chǎn)製造
3.進行了非臨床實(shí)驗(yàn)
5.可以在(zài)-80℃的(dí)冰箱(xiāng)中冷凍保(bǎo)存(cún)
6.不含動(dòng)物來(lái)源(yuán)的成份(fèn)
7.成分公(gōng)開(kāi)透明(míng)
8.擁(yōng)有日(rì)本原(yuán)料(liào)藥注冊證(zhèng)(MF)

應用實(shí)例
I 懸(xuán)浮細(xì)胞(bāo)和貼壁(bì)細胞(bāo)的冷(lěng)凍(dòng)方法

II 使(shǐ)用CP-1HG冷凍(dòng)保(bǎo)存(cún)/解(jiě)凍(dòng)造(zào)血(xiě)幹細胞的(dí)方法

III。 使(shǐ)用(yòng)CP-1HG間充質幹(gān)細(xì)胞冷凍保(bǎo)存(cún)/解凍(dòng)方法
冷凍保存液的製(zhì)備
·1.CP-1高等級,25%HSA,將(jiāng)介(jiè)質冷(lěng)卻至4℃。
·2.將(jiāng)CP-1高級6.8 mL,25%HSA 3.2 mL和10.0 mL培養基加(jiā)入離(lí)心管(guǎn)中(zhōng),並均匀(yún)混合(hé)。
·3.即將(jiāng)使(shǐ)用之前,請(qǐng)保(bǎo)存(cún)在4℃下(xià)。
細胞冷(lěng)凍保(bǎo)存
·1.用剝離溶液收(shōu)集要冷凍保存的細(xì)胞,並(bìng)計(jì)數(shù)細(xì)胞數。
·2.離心(xīn)除(chú)去上清液。
·3.預(yù)先添加已冷卻(què)至4°C的CP-1高品(pǐn)位/ 25%HSA /培(péi)養基(jī)(冷凍保存(cún)液-2的製備),均匀(yún)懸浮(fú)至1×106細胞/ mL。
·4.將(jiāng)各1 mL放入冷凍(dòng)管中(zhōng),放(fàng)入冷(lěng)凍(dòng)容器中,並在-80°C緩(huǎn)慢冷凍(dòng)。
·5.第(dì)二天(tiān)移(yí)至液(yè)氮或-150℃的深冷(lěng)櫃中(zhōng)。
解凍細胞
·1.事先(xiān)在(zài)離心管(guǎn)中(zhōng)準備9 mL培養(yǎng)基。
·2.從液(yè)氮中取出冷(lěng)凍(dòng)的(dí)冷凍(dòng)管,並在(zài)37°C的(dí)溫(wēn)水(shuǐ)浴中快速融化。
·3.將所(suǒ)有解凍的細(xì)胞(bāo)添加到(dào)培養基中(zhōng)並(bìng)離(lí)心(xīn)。
·4.除去上清(qīng)液,並(bìng)添加(jiā)適(shì)量(liáng)的(dí)培養基。
·5.在每(měi)種(zhǒng)使(shǐ)用(yòng)的細(xì)胞類型(xíng)的最(zuì)佳條件下(xià)進行(háng)培養(yǎng)。
IV 評價結(jié)果(間(jiān)充(chōng)質(zhì)幹細(xì)胞冷凍保(bǎo)存(cún))
V 使(shǐ)用(yòng)CP-1HG冷(lěng)凍(dòng)保(bǎo)存(cún)iPS / ES細胞並進行評估
Ⅰ. 懸浮細胞和(hé)貼壁(bì)細胞(bāo)的冷(lěng)凍方法
Ⅱ.CP-1®High Grade冷凍保(bǎo)存/解凍造血(xiě)幹細胞的方法Ⅲ.CP-1®High Grade應用於(yú)間(jiān)充(chōng)質(zhì)幹(gān)細(xì)胞冷(lěng)凍(dòng)保存/解(jiě)凍方法
冷凍(dòng)保存(cún)液(yè)的製備(bèi)
·1.CP-1高等(děng)級,25%HSA,將(jiāng)介(jiè)質(zhì)冷(lěng)卻(què)至(zhì)4℃。
·2.將(jiāng)CP-1高級6.8 mL,25%HSA 3.2 mL和10.0 mL培(péi)養基(jī)加(jiā)入離(lí)心管(guǎn)中,並(bìng)均匀混合(hé)。
·3.即將使用(yòng)之(zhī)前(qián),請保存在4℃下。
細(xì)胞冷凍保存
·1.用剝離溶(róng)液收集要(yào)冷凍保存的細胞(bāo),並計(jì)數(shù)細(xì)胞數。
·2.離心(xīn)除(chú)去(qù)上(shàng)清(qīng)液。
·3.預(yù)先(xiān)添(tiān)加已冷卻(què)至4°C的CP-1高品(pǐn)位(wèi)/ 25%HSA /培養基(冷(lěng)凍保存液(yè)-2的(dí)製備(bèi)),
均(jūn)匀懸浮至1×106細胞/ mL。
·4.將(jiāng)各1 mL放(fàng)入冷凍管中,放入冷凍容器(qì)中(zhōng),並在-80°C緩慢冷(lěng)凍(dòng)。
·5.第二(èr)天移(yí)至液氮或(huò)-150℃的(dí)深冷(lěng)櫃中。
解凍細胞(bāo)
·1.事先在離(lí)心管中(zhōng)準備(bèi)9 mL培養(yǎng)基(jī)。
·2.從(cóng)液氮(dàn)中(zhōng)取出(chū)冷凍的(dí)冷凍(dòng)管(guǎn),並(bìng)在37°C的(dí)溫水(shuǐ)浴中(zhōng)快速融化(huà)。
·3.將所有解凍(dòng)的細胞添加到(dào)培養基中並(bìng)離心。
·4.除去上清液(yè),並添加(jiā)適(shì)量(liáng)的培養(yǎng)基。
·5.在(zài)每種使(shǐ)用(yòng)的(dí)細胞類型的最佳條件下(xià)進行培養。
Ⅳ.評價(jià)結果(guǒ)(間(jiān)充(chōng)質幹(gān)細(xì)胞冷凍(dòng)保(bǎo)存)
[目的(dí)]關於(yú)有(yǒu)望在(zài)將來(lái)用(yòng)於再生醫學的(dí)人間充(chōng)質(zhì)幹細(xì)胞(bāo)(hMSCs)可(kě)以冷(lěng)凍(dòng)保存在CP-1高等級中,並(bìng)可以通(tōng)過廉價,方(fāng)便的幹冰穩定(dìng)地(dì)長期(qī)運(yùn)輸嗎(má)?
[方(fāng)法(fǎ)]將人脂(zhī)肪(fáng)來(lái)源的間充質幹細胞(MSC-AT)或(huò)人骨髓(suǐ)來(lái)源的(dí)間充質幹細胞(MSC-BM)冷凍在CP-1High Grade或(huò)對照中(下(xià)圖(tú)中的A)(1 x 106細(xì)胞) / mL),並儲存(cún)在液(yè)氮罐中(zhōng)。 儲存(cún)在液(yè)氮罐(guàn)中後(hòu),應在(zài)假(jiǎ)定(dìng)幹冰運(yùn)輸(shū)(-80°C·7天(tiān),-60°C·3天,60°C·7天(tiān)),融(róng)化後立(lì)即(jí)存活率和(hé)第二(èr)天培養的每(měi)種(zhǒng)條(tiáo)件(jiàn)下(xià)儲(chǔ)存 確認對血管(guǎn)的(dí)粘(nián)附(fù)率(粘附(fù)率=活細(xì)胞數/接種的活(huó)細胞數)。
[結(jié)果]在所有條件下(xià),融(róng)化後(hòu)的存活率均為90%以(yǐ)上(shàng),未觀(guān)察(chá)到差異(yì)(下(xià)圖(tú)B)。 然(rán)而(ér),在(zài)冷(lěng)凍的(dí)hMSC作(zuò)為(wéi)對(duì)照中,解(jiě)凍(dòng)後的(dí)第二天(tiān)在(zài)-60°C儲存(cún)時觀察到許多(duō)未粘附(fù)在培養箱中的死細胞(bāo),但是在CP-1中(zhōng)冷(lěng)凍(dòng)的hMSC中(zhōng)幾乎(hū)沒(méi)有觀(guān)察到(dào)死細胞(bāo),並且(qiě)幾(jī)乎沒有(yǒu)觀察到(dào)所(suǒ)有(yǒu)死細(xì)胞(bāo)。 連接細(xì)胞(bāo)(下圖中的(dí)B和C)。
[結論]由(yóu)於幹冰本(běn)身(shēn)的溫度(dù)約為-80°C,因此我們認為(wéi)在(zài)CP-1High Grade中冷凍的(dí)hMSC可以使(shǐ)用幹(gān)冰穩定(dìng)且長(cháng)期運輸(shū)。